جداسازی و شناسایی باکتریهای اسید لاکتیکی از شکمبه گوسفند مهربان

اختلالات متابولیکی نظیر اسیدوز شکمبه، یکی از مشکلات عمده ی صنعت دام پروری است که راه کارهای متعددی برای پیش گیری و کنترل این اختلال استفاده می شود. یکی از جدیدترین روش ها، دستکاری تخمیر شکمبه با استفاده از میکروب های زنده است. هدف از مطالعه حاضر جداسازی و شناسایی باکتری های تولید کننده و مصرف کننده لاکتات است که می توانند به عنوان پروبیوتیک ، برای تعدیل فعالیت میکروبی شکمبه استفاده شوند. به این منظور دو آزمایش طراحی شد. آزمایش اول، به منظور جداسازی باکتری های تولید کننده لاکتات به ترتیب زیر انجام شد. ابتدا گوسفندان نر فیستوله شده مهربان به جیره 70% کنسانتره سازگار شدند. پس از دو هفته شیرابه شکمبه آن ها روی محیط کشت mrs agar کشت داده شد و پس از 48 ساعت انکوباسیون در دمای ?c39، کلنی های منفرد تولید شده در شرایط بی هوازی، به محیط کشت مایع mrs broth دارای l-سیستئین، منتقل شدند. در مرحله بعد 2/0 میلی لیتر از محیط کشت رقیق شده با محلول ads (رقت های 8-10، 9-10 و 10-10) به لوله هانگیت دارای 45/0 میلی گرم آگار و 8/2 میلی لیتر محیط کشت مایع تلقیح و روی یخ رل تیوب شد. دو روز بعد، کلنی های منفرد و مشخص برداشته شده و به لوله های دارای محیط کشت پایه (bm) برای آزمایشات بیش تر منتقل شدند. در آزمایش دوم باکتری های مصرف کننده لاکتات جداسازی شد. شیرابه شکمبه گوسفندان فیستوله مهربان، روی محیط کشت lh دارای l-سیستئن، درون پتری دیش کشت داده شد. پس از 7-3 روز کلنی های منفرد به لوله هانگیت حاوی 45/0 میلی گرم آگار و 8/2 میلی لیتر محیط کشت lh دارای l-سیستئین، منتقل و روی یخ رل تیوب شدند. خلوص و خصوصیات مورفولوژی باکتری ها با روش رنگ آمیزی گرم بررسی شد. برای تشخیص باکتری های جداشده تست های بیوشیمیایی انجام شد و dna به روش جوشاندن و سرد کردن استخراج کردید. dna استخراج شده با تکنیک pcr تکثیر شدند. تکنیک rflp برای امتحان یکنواختی ژنتیکی جدایه ها با هضم dna استخراج آنها با آنزیم های برش دهنده ddei و alui هضم شدند. توالی محصول pcr حاوی ژن 16s rrna توسط شرکت bioneer کره جنوبی تعیین شد. توالی نوکلئوتیدها توسط نرم افزار تحت وب blastبرای تشخیص نزدیکترین جدایه خویشاوند در پایگاه داده-های بانک ژن آنالیز شد. درخت فیلوژنی برای توالی های به دست آمده توسط نرم افزار mega 5.2 رسم گردید. نتایج آزمایش اول نشان داد که باکتری های خالص شده از جنس کوکسی و باسیل گرم مثبت بودند. نزدیکترین خویشاوند (99%) جدایه های کوکسی entrococcus casseliflavus ec20 با شماره بانک ژن nr 102793.1 و نزدیکترین خویشاوند جدایه باسیل ccug43179 lactobacillus mucosae با شماره بانک ژن nr 102793.1 بودند. این باکتری ها فعالیت کاتالازی نداشتند و توانایی تولید ایندول را ندارند. جدایه های انتروکوکوس تمامی قندها را تخمیر کرداند. جدایه-های لاکتوباسیل را به صورت کامل تخمیر کردند؛ در حالی که گلوکز و مالتوز تاحدی و لاکتوز را به صورت ضعیف تخمیر کردند. در طی تخمیر گاز تولید نشد. نتایج آزمایش دوم نشان داد که این باکتری ها کوکسی های گرم منفی بودند که 99% با جدایه 20460 megasphaera elsdenii dsm با شماره بانک ژن nc 015873.1 مشابه بودند. این جدایه ها فعالیت کاتالازی داشتند اما ایندول تولید نکردند. این باکتری ها گلوکز و ساکارز را به خوبی و مالتوز را تا حدی مصرف کردند که با تولید گاز همراه بوده است. اما لاکتوز را تخمیر نکردند. با توجه به این که جدایه هایی از لاکتوباسیل ها و حتی انتروکوکوس ها در تک معده ای هایی مثل خوک و طیور و نیز انسان به عنوان پروبیوتیک استفاده می شوند، توصیه می شود که جدایه های اختصاصی برای تغذیه نشخوارکنندگان استفاده شوند. مگاسفرا السدنی مهم ترین باکتری مصرف کننده لاکتات در شکمبه است. تحقیقات نشان داده است که استفاده از این میکروارگانیسم به ویژه همراه با مخمرهایی نظیر ساکارومایسس سرویزیه، اثرات بسیار مفیدی بر تعادل میکروفلور شکمبه و فعالیت تخمیری آن دارد. جدایه جداسازی شده این میکروارگانیسم از شکمبه گوسفند مهربان با توجه به تفاوت آن با جدایه های موجود در بانک ژن می تواند آغازی برای تحقیق بیش تر در زمینه تولید پروبیوتیک حیوانی در ایران باشد.